PCR ප්‍රතික්‍රියා වල මැදිහත්වීම් සාධක

PCR ප්‍රතික්‍රියාව අතරතුර, සමහර බාධාකාරී සාධක බොහෝ විට හමු වේ.
PCR වල ඉතා ඉහළ සංවේදීතාව නිසා, දූෂණය PCR ප්‍රතිඵලවලට බලපාන වැදගත්ම සාධකයක් ලෙස සලකනු ලබන අතර එය ව්‍යාජ ධනාත්මක ප්‍රතිඵල ඇති කළ හැකිය.
ව්‍යාජ-සෘණ ප්‍රතිඵලවලට තුඩු දෙන විවිධ ප්‍රභවයන් ද ඒ හා සමානව තීරණාත්මක ය. PCR මිශ්‍රණයේ හෝ විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාවේ අත්‍යවශ්‍ය කොටස් එකක් හෝ කිහිපයක් නිෂේධනය කළහොත් හෝ බාධා කළහොත්, රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණයට බාධා ඇති විය හැකිය. මෙය කාර්යක්ෂමතාව අඩුවීමට සහ ව්‍යාජ සෘණ ප්‍රතිඵල පවා ඇති කිරීමට හේතු විය හැක.
නිෂේධනයට අමතරව, නියැදි සකස් කිරීමට පෙර නැව්ගත කිරීම සහ/හෝ ගබඩා කිරීමේ තත්වයන් හේතුවෙන් ඉලක්කගත න්‍යෂ්ටික අම්ල අඛණ්ඩතාව නැතිවීම සිදුවිය හැකිය. විශේෂයෙන්, ඉහළ උෂ්ණත්වයන් හෝ ප්‍රමාණවත් නොවන ගබඩා කිරීම සෛල හා න්‍යෂ්ටික අම්ල වලට හානි කිරීමට හේතු විය හැක. සෛල හා පටක සවි කිරීම සහ පැරෆින් කාවැද්දීම DNA ඛණ්ඩනයට සහ අඛණ්ඩ ගැටලුවකට ප්‍රසිද්ධ හේතු වේ (රූප 1 සහ 2 බලන්න). මෙම අවස්ථා වලදී, ප්‍රශස්ත හුදකලා කිරීම සහ පිරිසිදු කිරීම පවා උපකාරී නොවේ.

රූපය 1 | DNA අඛණ්ඩතාවයට නිශ්චලතාවයේ බලපෑම
මරණ පරීක්ෂණවල පැරෆින් කොටස් වලින් හුදකලා කරන ලද DNA වල ගුණාත්මකභාවය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වන බව ඇගරෝස් ජෙල් විද්‍යුත් විච්ඡේදනය මගින් පෙන්නුම් කරන ලදී. සවි කිරීමේ ක්‍රමය අනුව විවිධ සාමාන්‍ය කොටස් දිගකින් යුත් DNA සාරයන්හි පැවතුනි. දේශීය ශීත කළ සාම්පලවල සහ බෆර කළ උදාසීන ෆෝමලීන් වල සවි කළ විට පමණක් DNA සංරක්ෂණය කරන ලදී. දැඩි ආම්ලික බුයින් සවි කිරීමේ හෝ බෆර නොකළ, ෆෝමික් අම්ලය අඩංගු ෆෝමලීන් භාවිතය හේතුවෙන් සැලකිය යුතු DNA අලාභයක් සිදුවිය. ඉතිරි කොටස බෙහෙවින් ඛණ්ඩනය වී ඇත.
වම් පසින්, කොටස්වල දිග කිලෝබේස් යුගල (kbp) වලින් ප්‍රකාශ වේ.

රූපය 2 | න්‍යෂ්ටික අම්ල ඉලක්කවල අඛණ්ඩතාව නැතිවීම
(අ) කෙඳි දෙකෙහිම 3′-5′ පරතරයක් ඉලක්කගත DNA හි බිඳීමක් ඇති කරයි. කුඩා කොටසෙහි DNA සංස්ලේෂණය තවමත් සිදුවනු ඇත. කෙසේ වෙතත්, DNA කොටසෙහි ප්‍රයිමර් ඇනීලිං ස්ථානයක් නොමැති නම්, රේඛීය විස්තාරණය පමණක් සිදු වේ. වඩාත්ම හිතකර අවස්ථාවෙහිදී, කොටස් එකිනෙකා නැවත සංතෘප්ත කළ හැකි නමුත්, අස්වැන්න කුඩා වන අතර හඳුනාගැනීමේ මට්ටමට වඩා අඩු වනු ඇත.
(ආ) ප්‍රධාන වශයෙන් ඩිපියුරිනේෂන් සහ තයිමයිඩින් ඩයිමර් සෑදීම හේතුවෙන් භෂ්ම නැතිවීම, H-බන්ධන ගණන අඩුවීමට සහ Tm අඩුවීමට හේතු වේ. දිගටි උණුසුම් කිරීමේ අවධියේදී, ප්‍රයිමර් අනුකෘති DNA වලින් දිය වී යන අතර අඩු දැඩි තත්වයන් යටතේ පවා ඇනීල් නොවේ.
(ඇ) යාබද තයිමින් භෂ්ම TT ඩයිමරයක් සාදයි.
අණුක රෝග විනිශ්චය කිරීමේදී බොහෝ විට සිදුවන තවත් පොදු ගැටළුවක් වන්නේ ෆීනෝල්-ක්ලෝරෝෆෝම් නිස්සාරණයට සාපේක්ෂව ඉලක්කගත න්‍යෂ්ටික අම්ල මුදා හැරීම ප්‍රශස්ත නොවන බවයි. ආන්තික අවස්ථාවන්හිදී, මෙය ව්‍යාජ සෘණ සමඟ සම්බන්ධ විය හැකිය. තාපාංක ලයිසිස් හෝ සෛල සුන්බුන් එන්සයිම ජීර්ණය කිරීමෙන් බොහෝ කාලයක් ඉතිරි කර ගත හැකි නමුත්, මෙම ක්‍රමය බොහෝ විට ප්‍රමාණවත් න්‍යෂ්ටික අම්ල මුදා හැරීම හේතුවෙන් අඩු PCR සංවේදීතාවයකට හේතු වේ.

විස්තාරණය අතරතුර පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීම

සාමාන්‍යයෙන්, උපප්‍රශස්ත PCR ප්‍රතිඵලවලට තුඩු දෙන සියලු සාධක විස්තර කිරීම සඳහා නිෂේධනය බහාලුම් සංකල්පයක් ලෙස භාවිතා කරයි. දැඩි ජෛව රසායනික අර්ථයකින්, නිෂේධනය එන්සයිමයේ ක්‍රියාකාරිත්වයට සීමා වේ, එනම්, එය DNA පොලිමරේස් හෝ එහි සහකාරකයේ ක්‍රියාකාරී ස්ථානය සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කිරීම හරහා උපස්ථර-නිෂ්පාදන පරිවර්තනය අඩු කරයි හෝ වළක්වයි (උදා: Taq DNA පොලිමරේස් සඳහා Mg2+).
සාම්පලයේ ඇති සංරචක හෝ ප්‍රතික්‍රියාකාරක අඩංගු විවිධ බෆර සහ සාරය එන්සයිම සෘජුවම නිෂේධනය කිරීමට හෝ එහි සහ සාධක (උදා: EDTA) උගුලට හසු කර ගැනීමට හැකි අතර එමඟින් පොලිමරේස් අක්‍රිය කර PCR ප්‍රතිඵල අඩු කිරීමට හෝ ව්‍යාජ සෘණාත්මක කිරීමට හේතු වේ.
කෙසේ වෙතත්, ප්‍රතික්‍රියා සංරචක සහ ඉලක්ක අඩංගු න්‍යෂ්ටික අම්ල අතර බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා 'PCR නිෂේධක' ලෙසද නම් කර ඇත. සෛලයේ අඛණ්ඩතාව හුදකලා වීමෙන් බාධා වී න්‍යෂ්ටික අම්ලය මුදා හැරීමෙන් පසු, නියැදිය සහ එහි අවට ද්‍රාවණය සහ ඝන අවධිය අතර අන්තර්ක්‍රියා සිදුවිය හැකිය. නිදසුනක් ලෙස, 'කසළ ඉවත් කරන්නන්ට' සහසංයුජ නොවන අන්තර්ක්‍රියා හරහා තනි හෝ ද්විත්ව නූල් සහිත DNA බන්ධනය කළ හැකි අතර අවසානයේ PCR ප්‍රතික්‍රියා භාජනයට ළඟා වන ඉලක්ක ගණන අඩු කිරීමෙන් හුදකලා කිරීම සහ පිරිසිදු කිරීම සඳහා බාධා කළ හැකිය.
සාමාන්‍යයෙන්, PCR නිෂේධක බොහෝ ශරීර තරලවල සහ සායනික රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා කරන ප්‍රතික්‍රියාකාරකවල (මුත්‍රා වල යූරියා, රුධිරයේ හිමොග්ලොබින් සහ හෙපරීන්), ආහාර අතිරේකවල (කාබනික සංරචක, ග්ලයිකෝජන්, මේදය, Ca2+ අයන) සහ පරිසරයේ ඇති සංරචකවල (ෆීනෝල්, බැර ලෝහ) පවතී.

වඩාත් ප්‍රචලිත PCR නිෂේධක බැක්ටීරියා සහ යුකැරියෝටික් සෛල, ඉලක්කගත නොවන DNA, පටක අනුකෘතිවල DNA-බන්ධන සාර්ව අණු සහ අත්වැසුම් සහ ප්ලාස්ටික් වැනි රසායනාගාර උපකරණවල සොයාගත හැකිය. නිස්සාරණය අතරතුර හෝ පසුව න්‍යෂ්ටික අම්ල පිරිසිදු කිරීම PCR නිෂේධක ඉවත් කිරීම සඳහා වඩාත් සුදුසු ක්‍රමයයි.
අද වන විට, විවිධ ස්වයංක්‍රීය නිස්සාරණ උපකරණ බොහෝ අතින් ප්‍රොටෝකෝල ප්‍රතිස්ථාපනය කළ හැකි නමුත්, ඉලක්ක 100%ක් යථා තත්ත්වයට පත් කිරීම සහ/හෝ පිරිසිදු කිරීම කිසිදා සාක්ෂාත් කර ගෙන නොමැත. පිරිසිදු කරන ලද න්‍යෂ්ටික අම්ලවල විභව නිෂේධක තවමත් පැවතිය හැකිය, නැතහොත් දැනටමත් ක්‍රියාත්මක වී තිබිය හැකිය. නිෂේධකවල බලපෑම අඩු කිරීම සඳහා විවිධ උපාය මාර්ග පවතී. සුදුසු පොලිමරේස් තෝරා ගැනීම නිෂේධක ක්‍රියාකාරිත්වයට සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කළ හැකිය. PCR නිෂේධනය අඩු කිරීම සඳහා වෙනත් ඔප්පු කරන ලද ක්‍රම වන්නේ පොලිමරේස් සාන්ද්‍රණය වැඩි කිරීම හෝ BSA වැනි ආකලන යෙදීමයි.
අභ්‍යන්තර ක්‍රියාවලි තත්ත්ව පාලනය (IPC) භාවිතයෙන් PCR ප්‍රතික්‍රියා නිෂේධනය කිරීම පෙන්නුම් කළ හැක.
නිස්සාරණ කට්ටලයේ ඇති එතනෝල්, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, අයිසොප්‍රොපනෝල් සහ ෆීනෝල් ​​වැනි සියලුම ප්‍රතික්‍රියාකාරක සහ අනෙකුත් ද්‍රාවණ හොඳින් සේදීමේ පියවරක් මගින් නියුක්ලෙයික් අම්ල හුදකලාවෙන් ඉවත් කිරීමට ප්‍රවේශම් විය යුතුය. ඒවායේ සාන්ද්‍රණය අනුව, ඒවාට PCR සක්‍රිය කිරීමට හෝ නිෂේධනය කිරීමට හැකිය.