PCR ප්රතික්රියා වල බාධා සාධක

PCR ප්රතික්රියාව අතරතුර, සමහර බාධාකාරී සාධක බොහෝ විට හමු වේ.
PCR හි ඉතා ඉහළ සංවේදීතාව නිසා, PCR ප්රතිඵලවලට බලපාන වඩාත් වැදගත් සාධකයක් ලෙස දූෂණය සලකනු ලබන අතර ව්යාජ ධනාත්මක ප්රතිඵල ඇති කළ හැකිය.
ව්‍යාජ ඍණාත්මක ප්‍රතිඵලවලට තුඩු දෙන විවිධ මූලාශ්‍ර ද ඒ හා සමානව තීරණාත්මක වේ. PCR මිශ්‍රණයේ අත්‍යවශ්‍ය කොටස් එකක් හෝ කිහිපයක් හෝ විස්තාරණ ප්‍රතික්‍රියාවම අවහිර වී හෝ බාධා ඇති වුවහොත්, රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණයට බාධා කළ හැක. මෙය කාර්යක්ෂමතාව අඩු කිරීමට සහ ව්යාජ ඍණාත්මක ප්රතිඵලවලට පවා හේතු විය හැක.
නිෂේධනයට අමතරව, නියැදි සැකසීමට පෙර නැව්ගත කිරීම සහ/හෝ ගබඩා තත්ත්වයන් හේතුවෙන් ඉලක්කගත න්‍යෂ්ටික අම්ල අඛණ්ඩතාව නැතිවීම සිදුවිය හැක. විශේෂයෙන්, අධික උෂ්ණත්වය හෝ ප්රමාණවත් ගබඩා කිරීම සෛල හා න්යෂ්ටික අම්ල වලට හානි වීමට හේතු විය හැක. සෛල සහ පටක සවි කිරීම සහ පැරෆින් කාවැද්දීම DNA ඛණ්ඩනයට සහ නොනැසී පවතින ගැටලුවකට හොඳින් දන්නා හේතු වේ (රූප සටහන 1 සහ 2 බලන්න). මෙම අවස්ථා වලදී, ප්රශස්ත හුදකලා කිරීම සහ පවිත්ර කිරීම පවා උපකාර නොවනු ඇත.

රූපය 1 | DNA අඛණ්ඩතාව මත නිශ්චලතාවයේ බලපෑම
Agarose gel electrophoresis පෙන්නුම් කළේ මරණ පරීක්ෂණවල පැරෆින් කොටස් වලින් හුදකලා වූ DNA වල ගුණාත්මක භාවය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වන බවයි. සවිකිරීමේ ක්‍රමය මත පදනම්ව විවිධ සාමාන්‍ය කොටස් දිග ප්‍රමාණයේ DNA සාරය තුළ තිබී ඇත. DNA සංරක්ෂණය කර ඇත්තේ ස්වදේශික ශීත කළ සාම්පලවල සහ බෆර කළ උදාසීන ෆෝමලින්වල සවි කළ විට පමණි. දැඩි ආම්ලික Bouin fixative හෝ unbuffered, formic අම්ලය අඩංගු formalin භාවිතය DNA සැලකිය යුතු අලාභයක් ඇති විය. ඉතිරි කොටස බෙහෙවින් ඛණ්ඩනය වී ඇත.
වම් පසින්, කොටස්වල දිග කිලෝබේස් යුගල (kbp) වලින් ප්‍රකාශ වේ.

රූපය 2 | න්යෂ්ටික අම්ල ඉලක්කවල අඛණ්ඩතාව නැතිවීම
(a) නූල් දෙකෙහිම 3′-5′ පරතරයක් ඉලක්කගත DNA හි බිඳීමක් ඇති කරයි. DNA සංශ්ලේෂණය තවමත් කුඩා කොටස මත සිදුවනු ඇත. කෙසේ වෙතත්, DNA කොටසෙහි ප්‍රයිමර් ඇනීලිං අඩවියක් නොමැති නම්, සිදු වන්නේ රේඛීය විස්තාරණය පමණි. වඩාත්ම හිතකර අවස්ථාවෙහිදී, කොටස් එකිනෙක නැවත සංතෘප්ත විය හැකි නමුත් අස්වැන්න කුඩා වන අතර හඳුනාගැනීමේ මට්ටමට වඩා අඩු වනු ඇත.
(b) ප්‍රධාන වශයෙන් depurination සහ thymidine dimer සෑදීම හේතුවෙන් භෂ්ම නැතිවීම, H-බන්ධන සංඛ්‍යාවේ අඩුවීමක් සහ Tm හි අඩුවීමක් ඇති කරයි. දිග්ගැස්සුනු උනුසුම් අවධියේදී, ප්‍රයිමර් අනුකෘති DNA වලින් දිය වී යන අතර අඩු දැඩි තත්ත්‍වයන් යටතේ වුවද විවරණය නොවේ.
(ඇ) යාබද තයිමින් භෂ්ම ටීටී ඩයිමර් සාදයි.
අණුක රෝග විනිශ්චය කිරීමේදී බොහෝ විට සිදුවන තවත් පොදු ගැටළුවක් වන්නේ ෆීනෝල්-ක්ලෝරෝෆෝම් නිස්සාරණයට සාපේක්ෂව ඉලක්කගත න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රශස්ත ලෙස මුදා හැරීමයි. ආන්තික අවස්ථාවන්හිදී, මෙය ව්යාජ නිෂේධනයන් සමඟ සම්බන්ධ විය හැකිය. සෛල සුන්බුන් තාපාංක ලයිසිස් හෝ එන්සයිම ජීර්ණය කිරීමෙන් බොහෝ කාලයක් ඉතිරි කර ගත හැක, නමුත් මෙම ක්‍රමය බොහෝ විට ප්‍රමාණවත් න්‍යෂ්ටික අම්ල මුදා හැරීම නිසා අඩු PCR සංවේදීතාවයක් ඇති කරයි.

විස්තාරණය කිරීමේදී පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීම

සාමාන්‍යයෙන්, උපප්‍රශස්ත PCR ප්‍රතිඵලවලට තුඩු දෙන සියලුම සාධක විස්තර කිරීමට බහාලුම් සංකල්පයක් ලෙස නිෂේධනය භාවිතා කරයි. දැඩි ජෛව රසායනික අර්ථයකින්, නිෂේධනය එන්සයිමයේ ක්‍රියාකාරිත්වයට සීමා වේ, එනම්, එය DNA පොලිමරේස් හෝ එහි කෝෆැක්ටරයේ ක්‍රියාකාරී අඩවිය සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කිරීම හරහා උපස්ථර-නිෂ්පාදන පරිවර්තනය අඩු කරයි හෝ වළක්වයි (උදා: Taq DNA පොලිමරේස් සඳහා Mg2+).
නියැදියේ ඇති සංරචක හෝ ප්‍රතික්‍රියාකාරක අඩංගු විවිධ බෆර සහ සාරය සෘජුවම එන්සයිම නිෂේධනය කිරීමට හෝ එහි කෝෆැක්ටර් (උදා. EDTA) උගුලට හසු කර ගැනීමට හැකි වන අතර එමඟින් පොලිමරේස් අක්‍රිය කර PCR ප්‍රතිඵල අඩුවීමට හෝ ව්‍යාජ සෘණාත්මක වීමට හේතු වේ.
කෙසේ වෙතත්, ප්‍රතික්‍රියා සංරචක සහ ඉලක්ක අඩංගු න්‍යෂ්ටික අම්ල අතර බොහෝ අන්තර්ක්‍රියා 'PCR නිෂේධක' ලෙසද නම් කර ඇත. සෛලයේ අඛණ්ඩතාව හුදකලා වීමෙන් හා න්යෂ්ටික අම්ලය මුදා හැරීමෙන් පසු, නියැදිය සහ එහි අවට ද්රාවණය සහ ඝන අවධිය අතර අන්තර් ක්රියා සිදු විය හැක. නිදසුනක් ලෙස, 'කසල කරන්නන්ට' සහසංයුජ නොවන අන්තර්ක්‍රියා හරහා තනි හෝ ද්විත්ව නූල් ඩීඑන්ඒ බැඳිය හැකි අතර අවසානයේ PCR ප්‍රතික්‍රියා යාත්‍රාවට ළඟා වන ඉලක්ක සංඛ්‍යාව අඩු කිරීමෙන් හුදකලා කිරීමට සහ පිරිසිදු කිරීමට බාධා කළ හැකිය.
සාමාන්‍යයෙන්, PCR නිෂේධක සායනික රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා කරන බොහෝ ශරීර තරල සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක (මුත්‍රාවල යූරියා, හිමොග්ලොබින් සහ රුධිරයේ හෙපටින්), ආහාර අතිරේක (කාබනික සංරචක, ග්ලයිකෝජන්, මේදය, Ca2+ අයන) සහ පරිසරයේ ඇති සංරචක (ෆීනෝල්) වල පවතී. , බැර ලෝහ)

වඩාත් ප්‍රචලිත PCR නිෂේධක බැක්ටීරියා සහ යුකැරියෝටික් සෛල, ඉලක්ක නොවන DNA, පටක න්‍යාසවල DNA බන්ධන සාර්ව අණු සහ අත්වැසුම් සහ ප්ලාස්ටික් වැනි රසායනාගාර උපකරණවල සොයාගත හැකිය. PCR නිෂේධක ඉවත් කිරීම සඳහා න්‍යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණය අතරතුර හෝ පසුව පිරිසිදු කිරීම වඩාත් සුදුසු ක්‍රමය වේ.
අද, විවිධ ස්වයංක්‍රීය නිස්සාරණ උපකරණවලට බොහෝ අත්පොත ප්‍රොටෝකෝල ප්‍රතිස්ථාපනය කළ හැකි නමුත් 100% ප්‍රතිසාධනය සහ/හෝ ඉලක්ක පිරිසිදු කිරීම කිසි විටෙක සාක්ෂාත් කර ගෙන නොමැත. විභව නිෂේධක තවමත් පිරිසිදු කරන ලද න්යෂ්ටික අම්ලවල තිබිය හැක හෝ දැනටමත් ක්රියාත්මක වී ඇත. නිෂේධකයන්ගේ බලපෑම අඩු කිරීම සඳහා විවිධ උපාය මාර්ග පවතී. සුදුසු පොලිමරේස් තෝරාගැනීම නිෂේධක ක්රියාකාරිත්වයට සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කළ හැකිය. PCR නිෂේධනය අඩු කිරීම සඳහා වෙනත් ඔප්පු කරන ලද ක්‍රම වන්නේ පොලිමරේස් සාන්ද්‍රණය වැඩි කිරීම හෝ BSA වැනි ආකලන යෙදීමයි.
PCR ප්‍රතික්‍රියා වලක්වාලීම අභ්‍යන්තර ක්‍රියාවලි තත්ත්ව පාලනය (IPC) භාවිතයෙන් පෙන්නුම් කළ හැක.
නිස්සාරණ කට්ටලයේ ඇති එතනෝල්, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol සහ phenol වැනි සියලුම ප්‍රතික්‍රියාකාරක සහ අනෙකුත් ද්‍රාව්‍ය න්‍යෂ්ටික අම්ල හුදකලාවේ සිට හොඳින් සේදීමේ පියවරකින් ඉවත් කිරීමට සැලකිලිමත් විය යුතුය. ඔවුන්ගේ සාන්ද්‍රණය අනුව, ඔවුන් PCR සක්‍රිය කිරීමට හෝ අවහිර කිරීමට හැකිය.